2024年1月2日，深圳大學生命與海洋科學學院茍德明教授團隊在Nature出版社旗下期刊《Nature Communications》（影響因子：16.6）發(fā)表題為“Terminal modifications independent cell-free RNA sequencing enables sensitive early cancer detection and classification”的研究論文。深圳大學生命與海洋科學學院茍德明教授為通訊作者，王俊助理教授和黃金涌博士后為共同第一作者。
癌癥的早期診斷能夠延長患者的生存時間，增加治愈的可能性。隨著利用血漿中游離核酸進行液體活檢在癌癥檢測中的應用，可能實現(xiàn)癌癥早期診斷。盡管基于游離DNA的檢測方法（基因突變、拷貝數(shù)變化、甲基化變化、片段模式變化等）已顯示出在檢測與分類癌癥上的高特異性，但結合游離轉錄組信息可以提高它們在診斷早期癌癥的敏感性。血漿中游離RNA（cfRNA）代表了細胞外轉錄本的動態(tài)情況，腫瘤組織中相關轉錄物的變化可以在血液中cfRNA水平的變化體現(xiàn)出來，因此cfRNA具有廣泛的臨床價值。血漿中的游離信使RNA（mRNA）已被證明具有組織和癌癥特異性及細胞起源特異性，可用于疾病診斷和預后評估。然而，全面解析血漿中cfRNA面臨兩個主要障礙。首先，cfRNA提取效率較低，需要大量血漿（至少2毫升）用于檢測。其次，cfRNA高度片段化，導致其具有多樣的末端修飾結構，而傳統(tǒng)的RNA-seq文庫制備流程只對具有完整修飾末端的RNA片段有效，無法勝任對cfRNA的測序文庫制備。因此，迫切需要能夠有效處理低豐度和高度片段化樣品的cfRNA分析新技術。
深圳大學茍德明教授團隊長期致力于展非編碼RNA 在肺部疾病的發(fā)病機制和臨床轉化研究，發(fā)明了Direct S-Poly(T)Plus等基于熒光定量PCR的小分子RNA定量檢測技術。為了滿足高通量的需求，該團隊對此前技術進行優(yōu)化，開發(fā)了靈敏的血漿cfRNA文庫制備技術（SLiPiR-seq），該技術具有不依賴RNA末端修飾的優(yōu)勢，因此即使只用微量血漿（至少100微升）也依然能得到準確可靠的檢測結果。SLiPiR-seq對RNA的定量結果與金標準熒光定量PCR技術具有很高的相關性。對比傳統(tǒng)的接頭連接文庫制備方法，SLiPiR-seq可以在血漿中檢測到更多種不同類型的RNA，其中， mRNA和長非編碼RNA（lncRNA）的檢出量大大增加。由于可以更多的檢出與基因表達和調控相關的RNA種類，SLiPiR-seq技術在揭示血漿轉錄本與病理機制的關聯(lián)等研究中具有很好的前景。
為了評估SLiPiR-seq 技術在肺癌檢測中的應用效果，該研究對139 名肺癌患者和 106 名無癌癥個體的發(fā)現(xiàn)隊列進行了回顧性分析?；?cfRNA 計數(shù)的負二項分布模型在病例和對照之間確定了12840個差異表達的 cfRNA（padj<0.1）。將上述隊列隨機分成 80％作為訓練集，用來訓練機器學習診斷模型，將 20％作為測試集，用來評估模型的區(qū)分效果。本研究采用了邏輯回歸、隨機森林、支持向量機三種機器學習算法來系統(tǒng)地評估九類RNA的肺癌診斷效果。為了避免偏差，所有模型的隨機取樣和訓練-測試過程均重復進行了 100 次。九類RNA所訓練的模型在測試集中均取得了較好的分類效果。為了進一步評估診斷模型在檢測早期肺癌方面的效果，對來自另外兩個臨床中心的獨立驗證隊列進行分析，該隊列包括26 名 I 期肺癌患者和27 名健康人。驚喜的是，mRNA（AUC=0.846）、miRNA（AUC=0.905）、snoRNA（AUC=0.788）、snRNA （AUC=0.903）和tsRNA（AUC=0.741）五類RNA所訓練的模型可以精準區(qū)分I 期肺癌患者和健康人。將這五類RNA組合來訓練模型，發(fā)現(xiàn)由“mi+sn+sno”組成的模型具有最佳的早期肺癌檢測效果（AUC=0.979；發(fā)現(xiàn)隊列中靈敏性96.40%，特異性97.81%；獨立驗證隊列中靈敏性100%，特異性78.79%）。在大規(guī)模早期篩查中，為了避免假陽性，高特異性往往比高靈敏性更重要。因此，該研究指出由“m+sn+sno+ts”組合訓練的模型具有更高的特異性（發(fā)現(xiàn)隊列中靈敏性99.28%，特異性100%；獨立驗證隊列中靈敏性76.92%，特異性95.24%），更加適合肺癌早篩的情景。
為評估SLiPiR-seq在多癌種分類的可行性，研究團隊利用該技術額外對30例乳腺癌,37例結直腸癌,55例胃癌,15例肝癌進行了血漿cfRNA檢測。通過機器學習分析,研究團隊建立了一個通用的癌癥檢測模型和肺癌、乳腺癌、結直腸癌、肝癌、胃癌五種癌癥特異的診斷分類模型,證明了cfRNA的差異表達譜在癌癥診斷和分類中具有強大的性能。因此,血漿cfRNA可以作為癌癥的生物標志物應用于臨床。
總結來說，本研究為深入研究血漿cfRNA的組成及其在疾病中的生物學意義奠定了基礎。下一步,研究團隊將在大型樣本隊列中驗證SLiPiR-seq技術的臨床應用前景，期待基于該技術的cfRNA表達標志物在未來可以實現(xiàn)高準確性的早期癌癥檢測分類的臨床應用。
該研究得到了國家自然科學基金項目（82241022, 82170070, 81970053，89202586）、深圳市基礎研究面上項目（JCYJ20210324120206017），深圳市高等院校穩(wěn)定支持項目（8940317-0109）的支持。
文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-44461-y
（來源 生命與海洋科學學院）
