核酸適配體（aptamer）由諾獎獲得者Jack Szostak命名，是一類短的、單鏈DNA（ssDNA）或RNA寡核苷酸，通過形成三維空間結(jié)構(gòu)，結(jié)合特定蛋白或者細(xì)胞發(fā)揮作用?；谄洫毺氐纳飳W(xué)和化學(xué)特性，核酸適配體正在用于診斷試劑和治療藥物的開發(fā)。指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）是核酸適配體篩選的金標(biāo)準(zhǔn)方法，主要基于核酸文庫與目標(biāo)蛋白或細(xì)胞在溶液中或者在細(xì)胞表面的親和力作用，再結(jié)合深度測序捕獲富集序列。與此同時，對CRISPR/Cas的改造，已經(jīng)拓展出遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其天然核酸酶的功能，發(fā)展出了轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳調(diào)控、基因組標(biāo)記等豐富多彩的應(yīng)用。

近日，深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院王宇課題組，聯(lián)合廣州實驗室趙金存教授，清華大學(xué)譚旭研究員，中國科學(xué)院動物研究所周兵研究員以及深圳疾控中心張仁利教授，在Advanced Science（IF=17.5）上發(fā)表了題目為Repurposing CRISPR/Cas to Discover SARS-CoV-2Detecting and Neutralizing Aptamers的文章，報道了一種新穎的基于CRISPR/Cas的RNA配體篩選系統(tǒng)：CRISmers（CRISPR based aptamersscreening system）。有別于傳統(tǒng)的SELEX篩選，CRISmers將RNA適配體篩選從溶液體系或者細(xì)胞表面搬到了細(xì)胞內(nèi)，從而提供了胞內(nèi)天然生物環(huán)境下的RNA和蛋白質(zhì)的折疊與相互作用，并避免了篩選過程中的環(huán)境波動影響。CRISmers通過CRISPR/Cas的轉(zhuǎn)錄激活功能，將RNA適配體與靶蛋白的親和作用轉(zhuǎn)化為抗生素篩選壓力下細(xì)胞的存活能力，以每個單細(xì)胞作為相互隔離的物理單元，區(qū)分功能性事件和背景噪音。

首先，該團(tuán)隊設(shè)想了CRISmers的概念，然后應(yīng)用GFP和此前經(jīng)SELEX篩選獲得的RNA適配體進(jìn)行了初步的概念驗證和篩選系統(tǒng)的關(guān)鍵參數(shù)指征，從而得到了CRISmers篩選系統(tǒng)的工作流程。簡單來說，將適配體隨機(jī)序列文庫以pooled方式構(gòu)入進(jìn)sgRNA骨架，若文庫中含有與特定靶蛋白結(jié)合的親和序列，即可招募與靶蛋白融合的轉(zhuǎn)錄激活因子，從而激活下游抗性基因的表達(dá)。通過施加抗性篩選壓力，即可將攜帶親和配體的細(xì)胞在體系中富集。包含RNA適配體的文庫通過慢病毒遞送，整合進(jìn)入細(xì)胞基因組。RNA適配體的序列信息可以通過提取基因組、定向擴(kuò)增配體區(qū)段、以及深度測序獲取。

CRISmers理論上具有廣泛的靶向性，但考慮到研究進(jìn)行期間正值新冠疫情，該團(tuán)隊將第一個靶標(biāo)指向了SARS-CoV-2刺突蛋白受體結(jié)構(gòu)域RBD。通過初級篩選和二級驗證，獲得了可特異靶向RBD的2個優(yōu)選的RNA適配體，且在體外呈現(xiàn)出有效的病毒檢測和中和活性。有趣的是，和其他論文中報道的一致，核酸配體表現(xiàn)出不受病毒突變影響的現(xiàn)象，具有廣譜抗SARS-CoV-2的潛力。這一現(xiàn)象也許和核酸配體內(nèi)在的柔性結(jié)構(gòu)特性有關(guān)。類似的，不同的CRISPR/Cas系統(tǒng)的向?qū)NA也觀察到可以互換的現(xiàn)象。進(jìn)一步，選取其中一條RNA適配體，團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)，結(jié)合多種修飾和偶聯(lián)，包括2’-氟嘧啶和2’-甲氧基RNA修飾（提升RNA穩(wěn)定性），以及5’端膽固醇（呈遞到呼吸道上皮細(xì)胞表面）和分子量為40kDa的聚乙二醇（延長體內(nèi)半衰期）的偶聯(lián)，經(jīng)滴鼻給藥，在小鼠體內(nèi)實現(xiàn)了對Omicron BA.2活病毒的預(yù)防型和治療型抗病毒中和活性。通過對比實驗，團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)膽固醇和聚乙二醇的偶聯(lián)對于動物體內(nèi)的活性不可或缺，盡管它們對于細(xì)胞水平上的中和活性可有可無。

最后，該團(tuán)隊還對CRISmers系統(tǒng)的通用適配性進(jìn)行了驗證。應(yīng)用靶向SARS-CoV-2 RBD篩選獲得的兩個RNA配體，對CRISmers系統(tǒng)中的元件分別進(jìn)行了替換，包括（1）將dSpCas9替換成更小體積版本的dCasMINI-V4（2）將抗性基因替換成熒光蛋白；（3）將篩選宿主細(xì)胞由人HEK293T細(xì)胞系替換成大腸桿菌，均可捕獲到RNA配體與RBD的親和力信號。

近年來核酸藥物的成功主要來自于以“信息分子”發(fā)揮作用的方式，包括siRNA, ASO, mRNA。與之對應(yīng)的是，RNA作為“結(jié)構(gòu)分子”雖然對于生物學(xué)的很多方面也非常重要（某種意義上，CRISPR/Cas中的向?qū)NA就是一個大aptamer?。?，但是以這樣的角色轉(zhuǎn)化為藥物，雖然潛力巨大，但尚待發(fā)掘。CRISmers作為研究RNA作為“結(jié)構(gòu)分子”的工具技術(shù)將可能發(fā)揮一定的作用。另外，CRISmers盡管看起來也適用于膜外的靶標(biāo)，理論上而言對于膜內(nèi)的靶標(biāo)具有更加獨特的價值。siRNA和mRNA等核酸藥物跨過細(xì)胞膜對于實現(xiàn)它們的臨床應(yīng)用具有重要意義。隨著核酸遞送技術(shù)的進(jìn)步，胞內(nèi)靶點對于核酸藥物而言也許將逐步獲得和小分子化學(xué)藥一樣的可及性。因此，鑒于該論文的工作僅僅是CRISmers的第一個靶點，且位于病毒表面，該篩選系統(tǒng)尚待更多靶標(biāo)和更長時間的檢驗。當(dāng)下，基于上述成果，團(tuán)隊正在推進(jìn)抗新冠病毒的候選鼻噴藥物面向臨床應(yīng)用的開發(fā)工作。最新的測試顯示，論文中報道的優(yōu)選RNA適配體對于XBB.1.5和XBB.1.16假病毒保持活性。與此同時，面向后疫情時代，CRISmers正在被用于靶向癌癥等疾病的研究。

中國科學(xué)院動物研究所博士生張菊和廣州實驗室博士后朱愛如為該論文的共同第一作者，王宇教授、趙金存教授、譚旭研究員、周兵研究員、張仁利教授為該論文共同通訊作者。

原文鏈接：https://doi.org/10.1002/advs.202300656

（生命與海洋科學(xué)學(xué)院 供稿）